Esposizione ambientale ed occupazionale a benzene: identificazione di biomarcatori di esposizione, effetto e suscettibilità predettivi di rischio

Starting date
January 1, 2004
Duration (months)
24
Managers or local contacts
Fracasso Maria Enrica

Il test della cometa può essere utilizzato in cellule che si trovano in diversi stadi del ciclo cellulare anche se le cellule più frequentemente usate sono i linfociti che, oltre ad essere facilmente reperibili, presentano il vantaggio di costituire una popolazione sincronizzata. Il comet assay è stato eseguito su linfociti provenienti da sangue intero eparinizzato e dopo aver isolato le cellule è stata eseguita la conta e la vitalità cellulare. Successivamente le cellule sono state stratificate su un vetrino precedentemente preparato con la tecnica “sandwich”, lisate e quindi sottoposte ad elettroforesi submarine. Le condizioni alcaline utilizzate rompono i legami tra le due catene del DNA, i filamenti si separano e questo è un passaggio fondamentale in quanto durante l’elettroforesi le SSB (single strand breaks) migrano nel campo elettroforetico, formando la caratteristica coda. L’analisi dei vetrini viene fatta dopo colorazione con bromuro di etidio al microscopio in fluorescenza e i parametri di danno vengono valutati mediante software (Comet assay II, Perceptive Instruments, UK). I Parametri di danno al DNA considerati sono: la lunghezza della coda (TL), la % di DNA nella coda (TI), TM che è il prodotto integrato dei due parametri precedenti, ed il numero di comete nel campione, valutato con un valore cut-off inferiore al 95% di intensità di fluorescenza della testa. Per ogni soggetto vengono lette 50 cellule random in due esperimenti separati.

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