Batteri patogeni responsabili di malattie a trasmissione idrica: studio mediante saggi colturali e molecolari della loro persistenza nell'ambiente acquatico in forma vitale ma non coltivabile e in associazione al plancton.

Data inizio
1 gennaio 2001
Durata (mesi) 
24
Responsabili (o referenti locali)
Canepari Pietro
Parole chiave
MALATTIE A TRASMISSIONE IDRICA ; ENTEROCOCCHI ; FORME BATTERICHE VITALI MA NON C

L'acqua rappresenta una via molto efficiente di trasmissione di malattie da infezione dell'uomo. Da diversi anni si va rafforzando l'ipotesi che i batteri di interesse medico sopravvivano ben pi? a lungo di quanto prima fosse stimato. Ci? ? essenzialmente dovuto al fatto che essi sono in grado di attivare strategie di sopravvivenza se esposti a condizioni ambientali non ottimali (Kjelleberg et al., 1993; Moriarty and Bell, 1993). Lo stato vitale ma non coltivabile (VBNC) ? ormai riconosciuto tra quei meccanismi di sopravvivenza che attivano i batteri quando sono esposti a condizioni ambientali avverse quali, per esempio, i mezzi poveri o privi di nutrienti, la bassa temperatura, l'eccessiva salinit?(Roszak and Colwell, 1987; Oliver 1993, Barer and Harwood, 1999). In queste condizioni, i batteri, pur rimanendo vitali, perdono la capacit? di crescere sui convenzionali terreni di coltura, tuttavia essi mantengono le caratteristiche della loro virulenza ed in particolari condizioni e per taluni microrganismi si ? dimostrata la capacit? di recuperare la divisione al ripristino di un ambiente idoneo. A questo fenomeno ? stato attribuito il termine di "resuscitation" (Rahman et al., 1994; Oliver and Bockian, 1995; Jians and Chai, 1996; Lle? et al, 1998; Mizunoe et al., 1999). Sulla base delle considerazioni su esposte, si deduce che gli attuali metodi utilizzati per determinare la qualit? microbiologica di campioni ambientali, clinici o di cibi potrebbero non essere pi? considerati ottimali in quanto incapaci di rilevare la presenza di batteri in stato VBNC. I batteri in stato VBNC possono, pertanto, essere rilevabili con tecniche che non necessariamente prevedono la loro coltivazione e, tra queste, occorre menzionare le tecniche di tipo immunologico e le tecniche di biologia molecolare (Brauns et al., 1991; Islam et al, 1993). Il gruppo che fa capo all'UR di Verona ha gi? dimostrato la possibilit? di rilevare, mediante PCR, la presenza di Enterococcus faecalis in campioni di acqua prelevati dal Lago di Garda che erano risultati negativi alla ricerca con i metodi colturali convenzionali. Abbiamo anche messo a punto un metodo quantitativo che, mediante la co-amplificazione di un Internal Standard (cPCR), permette la precisa enumerazione di tale microrganismo. Il metodo è stato validato su campioni ambientali (Lle? et al., 1999). In queste prove il target dell'amplificazione ? stato il gene specie-specifico che codifica per la penicillin-binding protein 5 (PBP5) (Signoretto et al, 1994; Robbi et al, 1996). I limiti di questi metodi in biologia molecolare, seppure da considerare di grande vantaggio, vanno individuati nella loro incapacit? di discriminare le cellule ancora vitali da quelle gi? morte (Josephson et al, 1993), ammettendo che il DNA batterico rimanga stabile nel tempo in un campione ambientale in cui ? presente una flora e fauna eterogenea e complessa. La presenza di mRNA ? considerato un valido indice di vitalit? della cellula data la sua brevissima emivita all'interno di essa. Questi studi sono stati condotti su microrganismi quali Vibrio cholerae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae ed Escherichia coli (Bej et al., 1996; Klein and Juneja, 1997; Patel et al., 1993; Sheridan et al., 1998). Fino ad ora, tuttavia, non sono stati riportati dati in letteratura per quanto riguarda il rilevamento di specifici mRNA durante lo stato VBNC. In un nostro ulteriore e recente lavoro abbiamo dimostrato importanti modificazioni a carico della parete di E. faecalis in connessione con l'entrata nello stato VBNC. Tali alterazioni sono state riscontrate nella struttura chimica del peptidoglicano e sono accompagnate da specifiche alterazioni a carico degli enzimi connessi al suo metabolismo. In questo contesto gioca un importante ruolo la PBP5 di E. faecalis (Signoretto et al., 2000). Per questo motivo tale proteina sembrerebbe un buon candidato per la verifica della sua espressione nel corso dell'acquisizione e del mantenimento dello stato VBNC e quindi il suo mRNA un valido marcatore di cellule ancora vitali. Se queste prove daranno l'esito atteso, il pbp5 mRNA sar? utilizzato come target per allestire un kit diagnostico per il preciso e specifico rilevamento di E. faecalis in stato VBNC.

Enti finanziatori:

Ministero dell'Istruzione dell'Università e della Ricerca
Finanziamento: assegnato e gestito dal Dipartimento
Programma: PRIN

Partecipanti al progetto

Marzia Boaretti
Ricercatore
Barbara Bonato
Pietro Canepari
Cultore della materia
Carmine Fernanda Di Stefano
Maria Del Mar Lleo'Fernandez
Professore associato
Caterina Signoretto
Ricercatore
Maria Carla Tafi
Tecnico-Amministrativo

Attività

Strutture